目 的
本检测方法是用来确定本公司半纤维素酶的催化活性。本方法适用于各种固体和液体半纤维素酶酶制剂。
说 明
本方法适合于半纤维素酶的质量分析和质量控制领域。但不是本公司产品及其它公司产品的绝对活力的预测，而各种酶制剂的最终的酶活力在良好的实验操作下仍可发挥出更好的催化活力。
原 理
半纤维素被定义为碱溶性植物细胞壁的一类多糖，其中包括木聚糖、葡甘露聚糖、半乳糖甘露聚糖等多糖成分。木聚糖是半纤维素中最丰富的一种，植物界也分布最广。本法用半纤维素酶水解底物产生还原糖（以木糖计）与3,5-二硝基水杨酸（DNS）反应，产生颜色变化，这种颜色变化与释放的还原性糖（以木糖计）的量成正比关系，即与酶样品中的酶活性成正比。通过在550nm的光吸收值查对木糖标准曲线可以确定还原性糖产生的量，从而确定出酶的活力单位。
半纤维素酶活性的定义
1g酶粉（或1ml酶液）于50℃pH4.8条件下，每分钟分解1%木聚糖溶液产生1微克还原糖（以木糖）的酶量定义为一个半纤维素酶活力单位。
程 序
1. 试剂和仪器
*本标准所使用所有的试剂若无任何说明，均为分析纯
1.1 无水醋酸钠 1.2 冰醋酸 1.3 木聚糖（sigma公司产品）
1.4 3,5-二硝基水杨酸（DNS） 1.5 木糖 1.6 四水合酒石酸钾钠
1.7 氢氧化钠 1.8 苯甲酸 1.9 无水乙醇
1.10 水浴锅 1.11 计时表 1.12 分光光度计
1.13 沸水水浴器 1.14 一级玻璃制品 1.15 振荡混合器
2.试剂的制备
2.1 0.1M乙酸－乙酸钠缓冲溶液（pH=4.8）
溶液A：量取冰醋酸6ml，定容至1000ml，制成0.1M醋酸溶液。
溶液B：称取8.2g醋酸钠，溶解后容至1000ml，制成0.1M醋酸钠溶液。
使用是以A：B=4：6的比例混合，低温冷藏备用。
2.2 1%木聚糖溶液的配制
准确称取1.000g木聚糖用醋酸缓冲液（pH4.8）溶解并定容到100ml。
2.3 3，5-二硝基水杨酸（DNS）溶液
称取30g四水合酒石酸钾钠放入500ml锥形瓶内，加16gNaOH，加50ml无离子水，缓慢加热溶解，溶液变清澈后逐渐加入1g3，5-二硝基水杨酸，直至彻底溶解，冷却到室温，用无离子水定容至100ml。避光，避CO2保存，操作中戴手套。
2.4 标准木糖溶液的配制（1mg/ml）
木糖80℃烘干至恒重，准确称取1.000g溶于1000ml水中，加10mg叠氮化钠防腐。4℃冷藏备用。
2.5 酶样的制备
准确称取1.000g固体酶或移取1ml液体酶样，用pH4.8醋酸缓冲液溶解并定容至100ml，则该酶已经稀释100倍。
3. 标准曲线的绘制
3.1 取7支带有15ml刻度的试管，按下表取试剂
试管号 |
0 |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
取标准木糖溶液（ml） |
0 |
0.2 |
0.4 |
0.6 |
0.8 |
1.0 |
1.2 |
蒸馏水（ml） |
2 |
1.8 |
1.6 |
1.4 |
1.2 |
1.0 |
0.8 |
木糖的实际含量（mg/ml） |
0 |
0.1 |
0.2 |
0.3 |
0.4 |
0.5 |
0.6 |
DNS显色剂（ml） |
2 |
2 |
2 |
2 |
2 |
2 |
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沸水浴 |
5min |
定容 （ml） |
15 |
OD540 |
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3.2 上述过程同时进行三个平行，测得OD值与木糖mg数在计算机上或人工拟合曲线，求得Y=ax+b一元线性方程中间的a和b值。要求所绘曲线决定系数r2≥0.999。
4. 分析程序
4.1 对每个酶样须做三个平行，取4支试管各加0.2ml酶液
4.2 其中3支做测试管，各加入1.8ml的1%木聚糖底物，另一支做空白管，加入1.8ml的pH4.8的醋酸缓冲液。
4.3 四支试管均于50℃反应60分钟。
4.4 取出后每管加2mlDNS试剂,具塞,沸水煮10分钟。
4.5 冰浴冷却后，补水定容至15ml，充分混匀。
4 6 于550nm测OD，用空白管调零。
5.计算
5.1 将测得的各平行样求OD值的均值。
5.2 计算酶的活性单位依据以下公式
半纤维素酶的活力=  U/g(ml)
式中 x：为样品OD值的平均值
b和a由木糖浓度和相应的OD值通过回归方程求的
n：酶粉（液）的稀释倍数
60：酶促反应的时间
5：吸取了0.2ml酶液
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