目 的
　　 本检测方法是用来确定本公司蛋白酶的催化活性。本方法适用于各种固体和液体蛋白制剂。
说 明
　　 本方法适合于蛋白酶的质量分析和质量控制领域。但不是本公司产品及其它公司产品的绝对活力的预测，而各种酶制剂的最终的酶活力在良好的实验操作下仍可发挥出更好的催化活力。
原 理
　　 蛋白酶的水解底物很广泛，对酪蛋白、乳清蛋白、谷物蛋白等都有很好的水解作用。磷钨酸和磷钼酸混合试剂，即福林-酚试剂，碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原而呈蓝色反应（钨兰和钨兰混合物）。由于蛋白质中含有具有酚基的氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸），因此，蛋白质及其水解产物也呈此反应。利用蛋白酶分解酪素（底物）生成含酚基氨基酸的呈色反应，来间接测定蛋白酶的活力。
蛋白酶活力单位定义
　　 在40℃条件下,每分钟水解酪素产生相当于1μg酪氨酸所需的酶量,规定为一个酶活力单位。
程 序
1. 试剂和仪器
*本标准所使用所有的试剂若无任何说明，均为分析纯
1.1 酪素    1.2 三氯乙酸     1.3 碳酸钠     1.4 钨酸钠     1.5 钼酸钠
1.6 磷酸    1.7 浓溴水       1.8 浓盐酸     1.9 硫酸锂     1.10 磷酸氢二钠
1.11 磷酸二氢钠   1.12 乳酸    1.13 乳酸钠    1.14 硼酸钠    1.15 氢氧化钠
1.16 水浴锅       1.17 试管    1.18 滤纸      1.19 移液管    1.20 计时表
1.21 分光光度计   1.22 一级玻璃制品    1.23 振荡混合器
2. 试剂的制备
2.1 福林试剂的制备：
于200ml烧瓶回流装置内加入钨酸钠（Na2WO4·2H2O）100g，钼酸钠（Na2MO4·2H2O）25g蒸馏水700ml,85%磷酸50ml,浓盐酸100ml,小火回流10小时，去除冷凝器后加入硫酸锂（Li2SO4）50g,蒸馏水50ml和数滴浓溴水摇匀，在通风橱内再进行煮沸15分钟，以去除多余的溴（冷后若仍有绿色需再加溴水，再煮沸去过量的溴）。冷却后加蒸馏水定容至1000ml，混合均匀过滤。试剂呈金黄色贮于棕色试剂瓶内。使用时以1份原福林溶液与2份蒸馏水混匀（即为福林工作液）。
2.2 缓冲液的制备：
2.2.1 乳酸缓冲液（pH=3.0）适用于酸性蛋白酶
甲液：称取乳酸（80%-90%）10.6g,加水溶解并定容至1000ml。
乙液： 称取乳酸钠（70%）16g,加水溶解并定容至1000ml.
使用溶液：取甲液8ml,加乙液1ml,摇匀，稀释一倍，即成0.05mol/L乳酸缓冲溶液。
2.2.2 磷酸缓冲液的制备（pH=7.5）适用于中性蛋白酶
准确称取磷酸氢二钠（Na2HPO3.12Ｈ2Ｏ）6.02和磷酸二氢钠（NaH2PO3.2Ｈ2Ｏ）0.5g,加水定容至1000ml
2.2.3 硼酸缓冲液(pH=10.5) 适用于碱性蛋白酶
甲液：称取硼酸钠19.08g,加水溶解并定容至1000ml。
乙液： 称取氢氧化钠4.0g,加水溶解并定容至1000ml.
使用溶液：取甲液500ml,加乙液400ml,摇匀，用水稀释至1L。
2.3 0.4mol/L碳酸钠溶液：
准确称取无水碳酸钠42.4g,以蒸馏水溶解定溶至1000ml.
2.4 0.4mol/L的三氯醋酸液：
准确称取65.4三氯醋酸,以蒸馏水溶解定溶至1000ml
2.5 0.5mol/L的NaOH：
准确称取2g NaOH溶解并定至100ml
2.6 10.00mg/ml酪素溶液
称取酪素1.000g,准确至0.001g,用少量的0.5mol/L的氢氧化钠溶液(若为酸性蛋白酶则用浓乳酸2-3滴)润湿,,加入适量的各适宜的缓冲液约80ml,在沸水浴中边加热边搅拌,直至完全溶解,冷却后,转入100ml容量瓶中,用适宜的缓冲液稀释至刻度,此溶液在冰箱内贮存,有效期为三天.
2.7 100μg/ml酪氨酸标准溶液
2.7.1 准确称取预先于105℃干燥至恒重的L-酪氨酸0.1000g ,用1mol/L的盐酸60ml 溶解后定容至100ml,即为1.00mg/ml的酪氨酸溶液.
2.7.2 吸取1.00mg/ml酪氨酸标准溶液10.00ml,用0.1mol/L盐酸定容至100ml,即得100.0μg/ml L-酪氨酸标准溶液.
2.8 酶样的制备
准确称取1.000g固体酶或移取1ml液体酶样，用少量的适宜缓冲液溶解并用玻璃棒捣研,然后将上液倒入容量瓶,沉渣中再添入少量缓冲液捣研多次,最后全部移入容量瓶,稀释到刻度, 用四层纱布过滤。滤液可作为测试酶用.该酶已经稀释100倍。
3. 标准曲线的绘制
3.1 L-酪氨酸标准溶液按下表配制。

3.2分别取上述溶液各1.00ml(须做平行试验)，各加0.4mol/L碳酸钠溶液5.00ml。福林试剂使用溶液1.00ml,置于40+0.2℃水浴中显色20min,取出用分光光度计于波长680nm,比色，以不含酪氨酸的0管为空白管调零点，分别测定其吸光度值，以吸光度值为纵坐标，酪氨酸的浓度为横坐标，绘制标准曲线或计算回归方程。计算出当OD为1时的酪氨酸的量（μg），即为吸光常数K值，其K值应在95~100范围内。
4. 分析程序：
4.1 先将酪素溶液放入40+0.2℃恒温水裕中，预热5min
4.2 取4支试管，各加入1ml酶液
4.3 取一支作为空白管，加2ml三氯乙酸，其他3管作为测试管各加入1ml酪素，摇匀，40℃保温10min
4.4 取出试管，3支测试管中各加入2ml三氯乙酸，空白管中加1ml酪素。
4.5 静置10min，过滤沉淀
4.5 各取1ml滤液分别加0.4mol/L的Na2CO35ml，福林试剂1ml。在40℃显色20min。680nm处测OD值。以空白管调零点。
5. 计算
5.1 将测得的各平行样求OD值的均值。
5.2 计算酶的活性单位依据以下公式
　　 蛋白酶的活力= A×K×4/10×n U/g(ml)
　　　　 A：样品平行试验的平均OD值
　　　　 K：吸光常数
　　　　 4：反应试剂的总体积
　　　　 10：酶解反应时间
　　　　 n：酶液稀释总倍数