目 的
本检测方法是用来确定本公司β-葡聚糖酶的催化活性。本方法适用于各种固体和液体β-葡聚糖酶酶制剂。
说 明
本方法适合于β-葡聚糖酶的质量分析和质量控制领域。但不是本公司产品及其它公司产品的绝对活力的预测，而各种酶制剂的最终的酶活力在良好的实验操作下仍可发挥出更好的催化活力。
原 理
β-葡聚糖是谷物中的一种重要的非淀粉多糖，它是一种非分支多糖，主要由纤维三糖和纤维四糖单位组成，其中包括70%的β－（1→4）糖苷键和70%的β－（1→3）糖苷键。由于β－（1→3）键的存在，使β－葡聚糖分子形状不规则，表现出水溶性，同时β-葡聚糖具有一定的粘性。β－葡聚糖酶（EC.3.2.1.6）水解内切β－1，3（4）－D－葡聚糖苷键。释放出的还原性双糖基因与3,5-二硝基水杨酸（DNS）发生反应，产生颜色变化，这种变化与释放的还原性双糖的量成正比关系，即与酶样品中的酶活性成正比。通过在540nm的光吸收值查对标准曲线（以葡萄糖为标准物）可以确定还原糖产生的量，从而确定酶的活力单位。
β-葡聚糖酶活性的定义 :
1g酶粉（或1ml酶液）于50℃pH5.0条件下每分钟水解1%β-葡聚糖溶液产生1微克葡萄糖的酶量定义为一个β-葡聚糖活力单位。
程 序
1. 试剂和仪器
*本标准所使用所有的试剂若无任何说明，均为分析纯
1.1 无水醋酸钠 1.2 冰醋酸 1.3 大麦β-葡聚糖（sigma公司产品,粘度：24cSt）
1.4 3,5-二硝基水杨酸（DNS） 1.5 单水葡萄糖 1.6 四水合酒石酸钾钠
1.7 氢氧化钠 1.8 苯甲酸 1.9 无水乙醇
1.10 水浴锅 1.11 计时表 1.12 分光光度计
1.13 沸水水浴器 1.14 一级玻璃制品 1.15 振荡混合器
2. 试剂的制备
2.1 0.1M乙酸－乙酸钠缓冲溶液（PH5.0）
溶液A：量取冰醋酸6ml，定容至1000ml，制成0.1M醋酸溶液。
溶液B：称取8.2g醋酸钠，溶解后容至1000ml，制成0.1M醋酸钠溶液。
使用是以A：B=3：7的比例混合，低温冷藏备用。
2.2 1%的β-葡聚糖溶液的配制
准确称取0.25gβ-葡聚糖放入100ml锥形瓶中，加2ml无水乙醇摇匀到无可见颗粒。加20ml无离子水混合15分钟，盖紧塞子在沸水中煮5分钟，放置室温自然冷却，或用自来水流水降温。将已冷却到室温的底物溶液倾入一只25ml容量瓶中，加入2.5ml1M醋酸缓冲液（pH5.0），并用无离子水定容到25ml。
2.3 3,5-二硝基水杨酸（DNS）溶液
称取30g四水合酒石酸钾钠放入500ml锥形瓶内，加16gNaOH，加50ml无离子水，缓慢加热溶解，溶液变清澈后逐渐加入1g3,5-二硝基水杨酸，直至彻底溶解，冷却到室温，用无离子水定容至100ml。避光，避CO2保存，操作中戴手套。
2.4 0.1%苯甲酸
0.1g苯甲酸加入大约80ml无离子水中溶解，用无离子水定容至100ml。
2.5 10mg/ml标准葡萄糖溶液
称1g葡萄糖（恒重）溶于80ml0.1%苯甲酸溶液中，彻底溶解后，转移到100ml容量瓶中，用0.1%苯甲酸溶液定至100ml，配好的溶液可以在4℃保存三个月。
2.6 酶样的制备
准确称取1.000g固体酶或移取1ml液体酶样，用pH5.0醋酸缓冲液溶解并定容至100ml，则该酶已经稀释100倍。
3.标准曲线的绘制
3.1制作标准曲线做5个标准，准备一系列干净试管，每个稀释浓度做3个平行管，按下表取试剂
试管号 |
0 |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
取标准葡萄糖溶液（ml） |
0 |
0.2 |
0.4 |
0.6 |
0.8 |
1.0 |
蒸馏水（ml） |
10 |
9.8 |
9.6 |
9.4 |
9.2 |
9.0 |
葡萄糖的实际含量（mg/ml） |
0 |
0.2 |
0.4 |
0.6 |
0.8 |
1.0 |
DNS显色剂（ml） |
2 |
2 |
2 |
2 |
2 |
2 |
沸水浴 |
10min |
蒸馏水 （ml） |
10 |
10 |
10 |
10 |
10 |
10 |
OD540 |
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??3.2 测得OD值与葡萄糖mg数在计算机上或人工拟合曲线，求得Y=ax+b一元线性方程中间的a和b值。要求所绘曲线相关系数r≥0.999。
4. 分析程序
4.1 对于每一个被测酶样品，取1ml底物溶液置于四支试管(1ml/管),三支供测试酶活性，一支作空白,50±0.5℃保温2-3分钟.
4.2 加1ml酶稀释液向三个测试管中，空白管中加1ml无离子水代替酶稀释液。
4.3 四支试管均于50℃反应10分钟。
4.4 取出后每管加2mlDNS试剂,具塞,沸水煮5分钟。
4.5 冰浴冷却后，加10ml无离子水，充分混匀。
4 6 于540nm测OD，用空白管调零。
5. 计算
5.1 将测得的各平行样求OD值的均值。
5.2 计算酶的活性单位依据以下公式
β-葡聚糖酶的活力=  U/g(ml)
??
式中 x：为样品OD值的平均值
b和a由浓度和相应的OD值通过回归方程求的
n：酶粉（液）的稀释倍数
10：酶促反应的时间
F：底物校正因子（1.047）通常由底物提供厂家标明
W：酶样品的重量（1g或1ml）
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